質粒提取是分子生物學中一個基本而簡單的實驗。你不 不需要使用你的大腦，只需按照提取工具包中的說明來解釋這個傻瓜 s操作（事實上，這些簡單但耗時的實驗應該由實驗室里的機器人來操作）雖然操作簡單，但是質粒提取也是重要的一步質粒提取的質量和數量將直接決定后續實驗室的成敗。當我們按照套件中的說明操作時，我們會看到不同的解決方案，如P1P2N3PE和EB（不同的試劑盒可能有不同的標簽）那么你知道每瓶溶液里是什么嗎？它們在質粒提取中的作用是什么？

通過堿裂解提取質粒（Alkali decomposition）所以讓我們 讓我們看看P1P2N3PE和EB的解決方案是什么。

溶液1（P1）

成分濃度25mMTris-HCl（pH8.50mM葡萄糖，50mM葡萄糖（Glucose）

溶液1的主要功能是懸浮細菌沉淀。25 million tons-HCl是一種緩沖溶液，用于確保反應系統的恒定pH值。EDTA是金屬離子的螯合劑，10mMEDTA的作用是與微生物中的金屬離子結合，抑制DNA酶的活性。50mM葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，保證細菌的懸浮，延緩細菌的沉降時間。Rnase通常在使用前加入溶液1中（RNaseA）核糖核酸酶的作用非常明確，降解溶液中的RNA。由于核糖核酸酶屬于蛋白質，蛋白質的穩定性很差，所以加入核糖核酸酶的溶液1需要在4℃的低溫下保存。

溶液2（P2）

成分濃度250mMNaOH，1％W/V）SDS（十二烷基硫酸鈉）

溶液2的主要功能是細胞溶解。溶液1懸浮細胞后，需要加入溶液2，其作用是溶解細胞。解決方案2僅包括兩個組件：氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉。真正在細胞裂解中起作用的是氫氧化鈉，這也是為什么這種方法叫堿裂解。氫氧化鈉會破壞細胞膜的結構，使其雙層化（雙層膜）結構取向，膠束（微囊）結構的相變，導致細胞溶解。SDS的作用將在下一步提到。加入溶液2后需要注意的一點是時間一定不能太長，二是離心管不能劇烈晃動。時間過長和劇烈振動會使氫氧化鈉破壞基因組DNA，破碎的基因組DNA片段會和大小相近的質粒一起被提取出來，污染樣品。

溶液3（N3）

成分濃度3M醋酸鉀（potassium acetate），5M醋酸

溶液3的主要作用是中和第二步中加入的強堿，去除細胞中的蛋白質等雜質。Common is the abbreviation of neutralization。堿性溶液中的氫氧化鈉會長期破壞其與DNA基礎的結構，所以需要中和。要中和氫氧化鈉，5M醋酸就夠了，為什么還要加醋酸鉀？做過質粒提取實驗的同學應該記得，加入溶液N3后，會出現大量沉淀。這些沉淀實際上是溶液2中醋酸鉀與SDS相互作用產生的十二烷基硫酸鉀（英文名稱十二烷基硫酸鉀，PDS）加入溶液N3后，SDS遇到鉀離子，PDS不溶于水，會很快沉淀。

那么溶液3的加入是如何去除蛋白質基因組DNA等雜質的呢？原因是溶液2中加入的十二烷基硫酸鈉(SDS)容易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸會與一個SDS分子結合，它們的結合會形成SDS2多肽復合物，使變性的蛋白質溶解在溶液中，從而使多肽鏈更好地與基因組DNA糾纏在一起。加入溶液3后，由于十二烷基硫酸酯與變性蛋白結合成復合物，十二烷基硫酸酯的沉淀會將變性蛋白一起沉淀，同時變性蛋白會與基因組DNA糾纏在一起，大部分結果是共沉淀。高離子濃度的溶液加速沉淀過程。此外，溶液中和后變性蛋白表面電荷減少，也能促進變性蛋白的沉淀。

溶液PE（laundry bag）

成分濃度10mMTris-HCl（pH7.5），80%乙醇（Ethanol）

洗面奶的作用主要是洗去多余的鹽離子。所有的試劑盒都使用硅膠柱提取DNA。DNA吸附在硅膠柱上后，需要用洗臉盆洗去多余的鹽離子。洗衣袋含有高濃度的乙醇因為乙醇會影響后續的消化或測序反應，所以在洗脫DNA之前必須在離心機中”空甩”柱，完全除去乙醇。

溶液EB（Elution buffer）

成分濃度10mMTris-HCl（pH7.5）

EB的作用是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。洗脫緩沖液中不能含有過高濃度的鹽離子，因為在高鹽環境中，鹽陽離子會破壞硅膠負氧自由基與水的氫鍵，使整個硅膠帶正電荷，吸引帶負電荷的DNA分子。此外，加熱的洗脫液（50°C）可以加速DNA從硅膠膜上的分離。另外，離心前在膜上長時間保留EB緩沖液會更有利于DNA洗脫。

不同公司的質粒提取試劑盒中的溶液成分可能不一樣，比如P1可以去除葡萄糖，PE溶液甚至可以直接用水代替。質粒提取實驗是分子生物學中一個基本而重要的實驗雖然這個實驗本身很簡單，但它的原理有些復雜。邊肖認為，知道它是什么和為什么，知道實驗的原理，當實驗中出現問題時，就會更容易找到原因并加以糾正。